 Trong quá trình nuôi cấy, các dòng tế bào động vật có xu hướng thay đổi đặc tính di truyền khi nuôi cấy liên tục. Các dòng tế bào hữu hạn thì sẽ lão hóa dần. Tất cả các loại môi trường nuôi cấy tế bào đều dễ bị nhiễm vi khuẩn. Và, những sự cố thiết bị luôn có thể xảy ra dù với phòng thí nghiệm hiện đại nhất. Điều quan trọng là khi một dòng tế bào được thiết lập thì nó nên được xem là một nguồn tài nguyên quý giá và sự thay thế nó sẽ rất tốn kém và mất thời gian. Chính vì những lý do vừa nêu, chúng ta cần thực hiện trữ đông tế bào động vật. Phương pháp tốt nhất để trữ đông tế bào động vật là bảo quản chúng trong nitơ lỏng trongmôi trường hoàn chỉnh với sự có mặt của chất bảo vệ lạnh như dimethylsulfoxide (DMSO). Chất bảo quản lạnh làm giảm điểm đóng băng của môi trường và cũng cho phép tốc độ làm lạnh chậm hơn, giảm đáng kể nguy cơ hình thành tinh thể băng. Tinh thể băng có thể làm hỏng và gây chết tế bào.
Bài viết này cung cấp các nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật, bao gồm lựa chọn dòng tế bào thích hợp cho thí nghiệm của bạn, các yêu cầu về môi trường cho tế bào nuôi cấy, nuôi cấy tế bào động vật bám dính so với nuôi cấy huyền phù, pH và CO2 quan trọng như thế nào, v.v… Dòng tế bào động vậtTùy thuộc vào mục tiêu thí nghiệm của mình, bạn có thể lựa chọn dòng tế bào động vật theo một số tiêu chí sau:
Xem thêm Vắc-xin ngừa bệnh hoạt động như thế nào? Bạn có thể nuôi cấy tế bào động vật từ tế bào sơ cấp hoặc bạn có thể chọn mua các dòng tế bào từ các nhà cung cấp thương mại hoặc phi lợi nhuận (các ngân hàng tế bào). Các nhà cung cấp có uy tín thường sẽ cung cấp các dòng tế bào có chất lượng cao được kiểm tra cẩn thận về đặc tính và đảm bảo rằng không bị ngoại nhiễm. Bạn không nên mượn tế bào nuôitừ các phòng thí nghiệm khác vì chúng có nguy cơ bị ngoại nhiễm cao. Bất kể bạn sử dụng nguồn tế bào nào, bạn phải đảm bảo rằng tất cả các dòng tế bào mới đã được kiểm tra không nhiễm mycoplasma trước khi bạn bắt đầu sử dụng chúng. Môi trường nuôi cấy tế bàoMột trong những ưu điểm của việc nuôi cấy tế bào động vật là chúng ta có thể kiểm soát các thông số hóa lý (nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, nồng độ O2 và CO2) và thông số sinh lý (hormone, nồng độ các chất dinh dưỡng) để tế báo có thể tăng trưởng. Ngoại trừ nhiệt độ, các thông số khác có thể được kiểm soát bởi môi trường nuôi cấy. Tế bào bám dính và huyền phùCó hai hình thức cơ bản để tế bào phát triển trong nuôi cấy, đó là tế bào hình thành lớp đơn trên giá thể nhân tạo (tế bào bám dính) hoặc tế bào trôi nổi tự do trong môi trường nuôi cấy (tế bào huyền phù). Phần lớn các tế bào có nguồn gốc từ động vật có xương sống, ngoại trừ các dòng tế bào tạo máu và một số khác, phụ thuộc vào hiện tượng “neo” và phải nuôi cấy trên giá thể phù hợp được xử lý đặc biệt để cho phép tế bào bám vào vàphát triển. Tuy nhiên, nhiều dòng tế bào cũng có thể phù hợp với nuôi cấy dạng huyền phù như tế bào côn trùng. Các tế bào được nuôi cấy theo dạng huyền phù có thể được duy trì trong các bình nuôi cấy không cần xử lý bề mặt, nhưng sẽ yêu cầu biện pháp khuấy trộn phù hợp. Nêu những ưu điểm và triển vọng của phương pháp nhân giống vô tính trong ống nghiệm? + Tạo ra số lượng cá thể lớn trong một thời gian ngắn + Tạo ra các cá thể có kiểu gen và kiểu hình giống với cá thể gốc ban đầu → Giúp cho việc bảo tồn một số nguồn gen thực vật quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng. + Nhân nhanh nguồn gen quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng. + Nhân bản vô tính để tạo cơ quan nội tạng động vật từ các tế bào đã được chuyển gen người, chủ động cung cấp các cơ quan thay thế cho các bệnh nhân bị hỏng cơ quan tương ứng.
Nêu ưu và nhược điểm của việc áp dụng công nghệ tế bào trong việc nhân giống lợi ích và khuyết điểm của việc áp dụng công nghệ tế bào trong việc nhân giống cây so với việc giâm cành
Báo cáo chuyên đề CNSH 1Cán bộ hướng dẫnTs. Nguyễn Văn ThànhNhóm 1- Công nghệ Sinh Học K35Phạm Hoàng Nam 3092422Lợi Đức Linh 3092415Danh Thị Phương Nga 3092492Phạm Thị Đàm Mi 3092418Đinh Thị Bé Ngọc 3092495Nguyễn Văn QuắcDương Trọng TínLê Thanh Nhật 3096846Cần Thơ, tháng 09 năm 20101TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠVIỆN NC&PT CÔNG NGHỆSINH HỌC ĐẶT VẤN ĐỀCông nghệ sinh học đang trở thành một ngành công nghệ ứng dụng phát triển mạnh mẽ và là ngành khoa học mũi nhọn của thế kỉ 21.Công nghệ tế bào là một trong năm hướng phát triển cùa ngành công nghệ sinh học đã và đang đem lại những hiệu quả khoa học và kinh tế rất triển vọng trong sự phát triển của loài người .Việc trang bị kiến thức và kĩ năng về công nghệ tế bào cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học là điều bắt buộc trong các trường đại học có đào tạo về Công nghệ sinh học .NỘI DUNGGIỚI THIỆU CÔNG NGHỆ TẾ BÀO- Công nghệ tế bàoNgày nay, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy tế bào hoặc mô trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo ra những mô, cơ quan hoặc cơ thể hoàn chỉnh với đầy đủ các tính trạng của cơ thể gốc đã trở thành một ngành kĩ thuật, có qui trình xác định, được gọi là công nghệ tế bào.2- Lịch sử phát triểnVề công nghệ tế bào các nước đều đã sử dụng rộng rãi kỹ thuật nuôi cấy mô (tissue culture) dung hợp tế bào (cell fusion) chuyển nhân (nuclear transplantation)nuôi cấy các tế bào gốc, và đã có rất nhiều thành tựu.A.CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬTI.SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT1. CẤU TẠOHình 1: tế bào động vật2.CHỨC NĂNG3II.CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC1.TẾ BÀO GỐCa.Khái niệm: tế bào gốc là những tế bào không chuyên biệt (chưa biệt hóa) nhưng có khả năng trở thành các tế bào chuyên biệt và chức năng mới tương ứng.b.Chức năng: tế bào gốc được sử dụng để tạo các tế bào mới thay thế cho các tế bào già, chết tự nhiên, bị tổn thương, bị mất chức năng hay vì nguyên nhân khác .c.Nguồn gốcHình 2: Tế bào gốc phôiHình 3: Tế bào gốc phôi thaiHình 4: Tế bào gốc từ cuốn rốn trẻ sơ sinh4Hình 5: Tế bào gốc tủy xươngHình 6: Tế bào gốc từ răngHình 7: Tế bào gốc của người trưởng thành d.Phân loại tế bào gốc•T bào g c t ng năng: mế ố ổ i t bào có th phát tri n thành ỗ ế ể ểm t cá th m i.ộ ể ớ•T bào g c toàn năng: tế ố bào có th hình thành nên b t c ế ể ấ ứlo i t bào nào trong cạ ế ơ thể (trên 200 loại).•T bào g c đa năng: tế ố bào đã đ c bi t hóa, nh ng v n có ế ượ ệ ư ẫth hình thành nên m t s lo i t bào khác.ể ộ ố ạ ế5•Ghép các tế bào gốc tạo máu trong điều trị các tình trạng khác nhau của suy thoái hệ thống tạo máu. •Chữa trị các bệnh thuộc hệ thần kinh do sự thoái biến của các tế bào thần kinh. •Tái tạo da sau chữa trị bỏng.•Tái tạo mô cơ-xương qua thủ thuật ghép các tế bào gốc phôi•Ứng dụng vào các thủ thuật ghép tủy xương.• Trong thẩm mỹ: Các sản phẩm chăm sóc da Hình 8: Sản phẩm chăm sóc da từ tế bào gốcHình 9: Ngân hàng tế bào gốc2.ỨNG DỤNG61.CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN NẠP GENa.Chuyển nhiễm Dùng calcium phostphate kết tủa ADNb.Lipofection Sử dụng các lipid trung tính hoặc mang cation để tạo thành các liposome. Phức lipid hợp nhất với màng huyết tương sẽ phóng thích ADN dính bám vào trong phần bào tan (cytosol).c.Xung điệnd.Vi tiêmIII.ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENHình 8:Thiết bị vi tiêmHình 9: Vi tiêm DNA vào tế bào7(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm. (2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫn trứng.(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm.(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen đã chuyển.(5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di truyền về tính trạng mới.Hình 10: Quá trình vi tiêm8e.Dùng súng bắn genSử dụng các hạt kim loại như tungsten hoặc vàng làm vi đạn. Vi đạn được bọc bằng ADN và đi với một vận tốc thích hợp để xâm nhập vào tế bào đích.f.Dùng vector virus2.CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENHình 11: Qui trình chuyển gen động vật9a.Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế bào động vậtb.Tạo cơ sở vật liệu biến nạp genc.Chuyển gen vào động vậtd.Nuôi cấy phôi trong ống nghiệm (đối với động vật bậc cao)e.Kiểm tra động vật được sinh ra từ phôi chuyển genf.Tạo nguồn động vật chuyển gen một cách liên tục3.ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT CHUYỂN GEN Ở ĐỘNG VẬTa.Sản xuất thịtHình 12: lợn siêu nạcb.Sản xuất lenHình 13: Cừu sản xuất len10c.Sản xuất sữa Hình 14: Bò sữad.Giảm ô nhiễm photpho – Lợn enviro-pigHình 15: Lợn enviro-pige.Sản xuất BiosteelHình 16: Dê sản xuất biosteelf.Động vật thủy sinh chuyển genHình 17: Cá chuyển gen11h.Ứng dụng trong y họcHình 19: Gà chuy n gen đ ể ểnghiên c u quá trình phát ứtri n phôiểi.Kháng bệnh trong thú yg.Côn trùng chuyển gen Hình 18: Ruồi dấm12IV.NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ1.ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾa.Ưu điểm•S n xu t các phân t ph c t p và các kháng th dù ng làm ả ấ ử ứ ạ ểthu c phòng b nh, đi u tr ho c ch n đoánố ệ ề ị ặ ẩ•Các t bào đ ng v t đáp ng đ c quá trình h u d ch mã ế ộ ậ ứ ượ ậ ịchính xác đ i v i các s n ph m protein sinh-d c ố ớ ả ẩ ượ(biopharmaceutical protein).•S n xu t các viral vector dùng trong li u pháp genả ấ ệ•S n xu t các t bào đ ng v t đ dùng nh m t c ch t ả ấ ế ộ ậ ể ư ộ ơ ấ in vitro trong nghiên c u đ c ch t h c và d c h c.ứ ộ ấ ọ ượ ọ•S n xu t các c quan thay th nhân t o-sinh h c/các d ng ả ấ ơ ế ạ ọ ục tr giúp.ụ ợ13b.Hạn chế•Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật.•Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm nên sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn.•Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương mỏng kết quả là chúng rất dễ bị vỡ. • Môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền.•Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.2.CÁC DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA NÓa.Các tế bào dịch huyền phùCác tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù (suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in vitro.143.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚb.Các tế bào dính bámHầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám (cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng). Người ta sử dụng rộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast). Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muối khoáng và glucose. Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thể tích) huyết thanh của động vật có vú.4.CÁC SẢN PHẨM THƯƠNG MẠI CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚCác sản phẩm sinh học được sản xuất bằng tế bào động vật có vú chủ yếu là các glycoprotein.15Nhóm IEnzymeUrokinase, hoạt tố plasminogen môHormoneHormone sinh trưởng (GH)Các nhân tố sinh trưởng Các cytokine khácNhóm II VaccineBệnh dại, bệnh quai bị, bệnh sởi ở người…Veterinary-FMD vaccine, New Cattle’s Disease Nhóm III Kháng thể đơn dòng Các công cụ chẩn đoánNhóm IV Virus côn trùngThuốc trừ sâu sinh học cho BaculovirusNhóm V Các chất điều hòa miễn dịch Interferon và interleukinNhóm VI Các tế bào nguyên vẹn Thử nghiệm độc chất họcBảng 1. Các sản phẩm quan trọng của nuôi cấy tế bào động vật16V.NHÂN BẢN VÔ TÍNH Ở ĐỘNG VẬT1.KHÁI NIỆM 2.QUY TRÌNH THỰC HIỆNNhân bản vô tính là phương pháp sinh sản đơn không thông qua thụ tinh (không phân biệt giới tính). Bằng phương pháp này các cá thể có thể được tạo ra từ một tế bào lấy từ nguyên bản.Hình 20: qui trình nhân bản vô tính cừu Dolly17Thú cảnh nuôi3.ỨNG DỤNGHình 21: Bản sao Snuppy và “bố” của nó Hình 22: Mèo CCHình 23: Cừu Dolly18Hình 25: Lợn nhân b nả Hình 26: 3 th h chu t nhân ế ệ ộb nảHình 24: Bò nhân b nảGia súc nhân bản19B. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬTI. SƠ LƯỢC VỀ TẾ BÀO THỰC VẬT1. CẤU TRÚC TẾ BÀO THỰC VẬT2. CHỨC NĂNG TẾ BÀO THỰC VẬT20II.NUÔI CẤY MÔ1.ĐẶC ĐIỂMa.Nuôi cấy mô: tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm.b.Cơ sở sinh lí:•Tính toàn năng: khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hòa chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp•Sự phân chia phân hóa, phản phân hóa của tế bàoPhân hóa: 1 tế bào, 1 khối tế bào phân hóa thành mô, cơ quan, hệ cơ quan.Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu ki gặp điều kiện thuận lợi.21c.Các nhân tố đảm bảo thành công trong công nghệ nuôi cấy mô- tế bào thực vật:•Đảm bảo điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao.•Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách.•Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.d.Các bước trong kĩ thuật nuôi cấy mô- tế bào thực vật•Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất khử trùng cấy trong môi trường khởi động để tái sinh •Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi.•Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các chồi cho vào môi trường tạo rể (bố sung Auxin) mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh.•Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đủ tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được chuyển sang môi trường tự nhiên.222.SƠ LƯỢC CÁC KỸ THUẬT DÙNG TRONG NUÔI CẤY MÔA. Mô sẹo từ Catharanthus roseus. (B)Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp. (C) Nốt sần C. roseus. (D) Đầu rễ từ C. roseus. (E)Tái sinh cây từ C. roseus callus. (F) Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana. (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora. (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum.Hình 27: Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật23a.Nuôi cấy phôi nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển củaphôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên.b.Nuôi cấy mô và cơ quan tách rờiNhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng ( nito, phospho, kali, calxi) và vi lượng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn, ).Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin (B1, B6, B3, ) và các chất điều hoà sinh trưởngĐối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol.24c. Nuôi cấy mô phân sinhMô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm÷ 1cm.Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống invitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.d. Nuôi cấy bao phấnHạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quane. Nuôi cấy tế bào đơnTế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau.25 |
